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瑞諾知識(shí)分享 || 蛋白翻譯后修飾研究：Middle-down分析方式

發(fā)布時(shí)間： 9/22/2022 3:21:02 PM

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背景介紹

Bottom-up的分析策略是一種將蛋白質(zhì)/酶的大片段混合物分解成小片段的肽段以進(jìn)行分析的策略，被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)組學(xué)研究。

Middle-down的分析策略使用不同的酶來(lái)獲得較長(zhǎng)的肽，采用此方法可以分析較長(zhǎng)的肽鏈上同時(shí)發(fā)生的幾種翻譯后修飾。

Top-down分析策略不需要進(jìn)行酶解過(guò)程，直接分析完整的蛋白質(zhì)，這種方法可以獲得完整的生物學(xué)信息。

下面將簡(jiǎn)單介紹Middle-down方法在蛋白質(zhì)/蛋白質(zhì)組學(xué)分析及抗體藥物分析方面的應(yīng)用。

Middle-down是一種新興的方法，可用于研究蛋白質(zhì)以及蛋白質(zhì)組學(xué)。Middle-down方法涉及蛋白水解或化學(xué)降解步驟（這是Bottom-up方法的特征）獲得的短肽（而不是“完整蛋白質(zhì)”），但所得肽段的大小比Bottom-up方法中得到的肽段大。利用Bottom-up方法通常得到長(zhǎng)度約為7-20個(gè)氨基酸殘基（M：0.8-2kDa），Middle-down將生成長(zhǎng)度為約20-100個(gè)氨基酸的肽段，分子量（M）：2.5kDa

Middle-down的檢測(cè)流程，簡(jiǎn)述如下：

1、蛋白質(zhì)水解

通過(guò)優(yōu)化蛋白水解的孵育時(shí)間或通過(guò)適當(dāng)控制酶和底物的相對(duì)濃度，對(duì)蛋白質(zhì)的Middle-down研究進(jìn)行了限制性消化，使用廣泛可用且相對(duì)便宜的蛋白酶，如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和胃蛋白酶。為了簡(jiǎn)化此過(guò)程，已有一些特殊的酶如OmpT、Sap9和IdeS用于Middle-down的檢測(cè)。OmpT是一種屬于omptin家族的新型蛋白酶，具有催化連續(xù)二堿基位點(diǎn) K↓R、R↓R、R↓K和K↓K之間肽鍵切割的特異性；Sap9（白色念珠菌) 是一種源自yapsin家族的天冬氨酸蛋白酶；兩種酶都能夠產(chǎn)生長(zhǎng)度>2kDa的肽；IdeS是一種半胱氨酸蛋白酶，一種來(lái)自Streptococcus pyogenes的免疫球蛋白降解酶，可特異性切割所有IgG亞類(lèi)的鉸鏈區(qū)，通過(guò)IdeS市售抗體西妥昔單抗、利妥昔單抗等進(jìn)行IdeS處理，獲得了三種更大尺寸的蛋白水解肽。

2、分離

與基因組研究相比，蛋白質(zhì)組學(xué)研究相對(duì)更復(fù)雜，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)組學(xué)研究涉及蛋白質(zhì)同種型、翻譯后修飾和各種分析的表征，以監(jiān)測(cè)細(xì)胞/組織生長(zhǎng)不同階段的表達(dá)水平。因此，不同類(lèi)型的分離策略對(duì)于蛋白質(zhì)組學(xué)至關(guān)重要，以降低蛋白質(zhì)組的復(fù)雜性。各種分離或色譜方法的應(yīng)用可以顯著影響 MS 對(duì)低豐度水平的蛋白質(zhì)/蛋白水解肽的檢測(cè)和分析。蛋白質(zhì)組的分離包括凝膠電泳、毛細(xì)管電泳、反相色譜。

3、質(zhì)譜檢測(cè)

質(zhì)譜儀基本上具有三個(gè)模塊，即離子源或電離源、質(zhì)量分析器和檢測(cè)器。由于 ESI和MALDI等軟電離方法的出現(xiàn)，這兩種電離模式可以成功地應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域，主要是為了完整的分子量測(cè)量。事實(shí)上，蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域的快速發(fā)展主要是通過(guò)應(yīng)用這兩種電離模式來(lái)推動(dòng)的。MALDI主要產(chǎn)生完整肽或蛋白質(zhì)分子的單質(zhì)子化離子，而蛋白質(zhì)或肽的多質(zhì)子化離子種類(lèi)通過(guò)ESI檢測(cè)/產(chǎn)生。

從大腸桿菌到釀酒酵母，從中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢（CHO）細(xì)胞到轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，多種宿主已被成功用于生物技術(shù)藥物生產(chǎn)，在用于藥物生產(chǎn)前，一般通過(guò)基因工程手段改造宿主的遺傳信息以適于高效的藥物生產(chǎn)，對(duì)改造的遺傳信息和藥物序列分析是產(chǎn)品/工藝開(kāi)發(fā)和質(zhì)量研究的重要部分。將改造的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染表達(dá)細(xì)胞（例如CHO），加壓篩選出可穩(wěn)定表達(dá)目的基因的細(xì)胞株，經(jīng)過(guò)放大培養(yǎng)、純化獲得目的產(chǎn)物。

篩選得到的細(xì)胞株在傳代過(guò)程中可能發(fā)生遺傳突變，這將導(dǎo)致細(xì)胞群的微觀異質(zhì)性，而且突變株還可能獲得選擇優(yōu)勢(shì)而產(chǎn)生克隆替換。在包括疫苗、基因治療和治療性蛋白等生物技術(shù)藥物的生產(chǎn)過(guò)程中，這些自發(fā)性突變對(duì)最終產(chǎn)品的質(zhì)量構(gòu)成風(fēng)險(xiǎn)，因此對(duì)最終的蛋白產(chǎn)物進(jìn)行氨基酸序列的分析至關(guān)重要。蛋白藥物具有很高的異質(zhì)性，這些藥物利用不同的表達(dá)系統(tǒng)（例如CHO細(xì)胞）產(chǎn)生，同時(shí)會(huì)伴隨多種修飾，例如糖基化、N端焦谷氨酰胺環(huán)化、C端賴氨酸加工、脫酰胺、異構(gòu)化和氧化。

當(dāng)將蛋白質(zhì)等生物大分子引入質(zhì)譜儀時(shí)，它們會(huì)被離子化并以各種電荷狀態(tài)進(jìn)行檢測(cè)，因此檢測(cè)靈敏度低于肽。相比之下，使用LC-MS/MS對(duì)胰蛋白酶消化獲得的肽片段進(jìn)行定量的自下而上蛋白質(zhì)組學(xué)提供了更高的檢測(cè)靈敏度和良好的選擇性。對(duì)于日常的治療藥物監(jiān)測(cè)，可以使用這三種方法中的任何一種來(lái)實(shí)現(xiàn)。然而，對(duì)于臨床前PK和TK中的少量血樣使用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行分析，或用于監(jiān)測(cè)人體臨床研究中的藥物消失，需要LLOQ低于1μg/L的更高靈敏度檢測(cè)。這種分析通常通過(guò)自下而上的方法進(jìn)行。

由于糖鏈結(jié)構(gòu)的多樣化，色譜圖和MS光譜中都會(huì)出現(xiàn)多個(gè)峰，因此Top-down的蛋白質(zhì)組學(xué)方法不適合高靈敏度的生物分析。已經(jīng)報(bào)道利用Middle-down蛋白質(zhì)組學(xué)方法將治療性mAb轉(zhuǎn)化為高同質(zhì)性和低分子量片段并使用高分辨率質(zhì)譜法對(duì)其進(jìn)行量化。治療性mAb的IgG用IdeS消化以產(chǎn)生F(ab')2和Fc/2片段，用還原劑處理F(ab')2裂解二硫鍵并將F(ab')2轉(zhuǎn)化為兩條輕鏈和兩條約25kDa的Fd鏈。使用IdeS的Middle-??down蛋白質(zhì)組學(xué)方法用于評(píng)估抗體的復(fù)雜性、長(zhǎng)期儲(chǔ)存穩(wěn)定性和治療性mAb制劑的生物相似性。

下表總結(jié)了使用Middle-down方法的治療性抗體的應(yīng)用。

Middle-down方法已經(jīng)廣泛用于蛋白質(zhì)組學(xué)及抗體藥物的表征分析。Middle-down方法可能是識(shí)別和表征蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)組的更好選擇，它可以彌補(bǔ)Bottom-up和Top-down研究的不足，因此它對(duì)于實(shí)現(xiàn)各種生物學(xué)目標(biāo)是必不可少的。

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參考文獻(xiàn)

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