內(nèi)毒素
內(nèi)毒素(即革蘭氏陰性菌細胞壁的脂多糖分子，lipopolysaccharide，LPS)是研究最透徹也是最常見的生物熱原，注射即使是 pg 級別的痕量 LPS 也會導(dǎo)致病人嚴重的熱原反應(yīng)，引起人體發(fā)熱、休克甚至死亡。內(nèi)毒素普遍存在且不易滅活，對制藥和醫(yī)療器械行業(yè)是一個挑戰(zhàn)。因此生物制品類、注射用藥劑、化學(xué)藥品類、放射性藥物、抗生素類、疫苗類、透析液等制劑以及醫(yī)療器材類(如一次性注射器，植入性生物材料)都需檢測內(nèi)毒素含量，符合標準的才允許投入市場銷售。同時，靈敏可靠的內(nèi)毒素檢測技術(shù)也是必須的。隨著時代的發(fā)展，內(nèi)毒素檢測方法也在不斷更新。
上圖5種方法中，凝膠法可做定性判斷，其他 4 種方法能夠進行定量檢測，通過標準曲線的繪制，計算出待測樣品的內(nèi)毒素含量。本文介紹的重組 C 因子法，通過內(nèi)毒素結(jié)合并激活的重組 C 因子能夠切割底物獲得游離的熒光基團，熒光基團的釋放與內(nèi)毒素的濃度呈正比，從而使得內(nèi)毒素被定量檢測。與其他 3 種定量檢測方法相比，具有更好的特異性，不受旁路 G 因子的干擾，見下圖示意。
2021 年 2 月 5 日，國家林業(yè)和草原局、農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布公告(2021 年第 3 號)，調(diào)整后的?國家重點保護野生動物名錄?正式發(fā)布，將我國分布的鱟科動物(中國鱟、圓尾蝎鱟)升級為國家二級保護動物。隨后，3 月 22 日，湛江安度斯發(fā)布公告稱，由于受國家政策影響，內(nèi)毒素檢測試劑原料將受到嚴格管控，并表示迫于形勢，決定停止供應(yīng)以下產(chǎn)品：
● 單支凝膠法鱟試劑(0.1mL)- 靈敏度 0.5、0.25、0.125、0.06 EU/mL 將于今年 6 月 30 日停產(chǎn)
● 四次裝凝膠法鱟試劑(0.5mL)- 靈敏度 0.25、0.125EU/mL 將于今年 12 月 31 日停產(chǎn)
文中表示，國內(nèi)藥品、醫(yī)療器械放行將面臨困境，并建議藥企、醫(yī)療器械企業(yè)盡早選擇其他替代測試方法。對于經(jīng)常使用內(nèi)毒素檢測試劑的小伙伴來說，這無疑是一則重磅消息，畢竟在內(nèi)毒素檢測方面，鱟試劑是中國藥典通則規(guī)定使用的試劑之一，也是其中被應(yīng)用地最為廣泛的一種。
不過，我們可以同樣在藥典中找到解決之法——重組 C 因子法，該方法目前已被多家全球監(jiān)管機構(gòu)所接受，是未來內(nèi)毒素檢測方法的發(fā)展方向：
2018 年 9 月 27 日
FDA 已批準 rFC 用于 Eli Lilly 的偏頭痛藥品 Galcanezumab 的最終產(chǎn)品的細菌內(nèi)毒素檢測及產(chǎn)品放行。
2020 年 6 月
2020 版中國藥典《9251 細菌內(nèi)毒素檢查法應(yīng)用指導(dǎo)原則》提出，可使用重組 C 因子法進行內(nèi)毒素檢查。
2020 年 9 月
USP 新增通則<1085.1>，將重組試劑進行細菌內(nèi)毒素的檢測方法正式收錄于《美國藥典-國家處方集》(USP-NF)中。
2021 年 1 月 1 日
歐洲藥典EP 2.6.32 正式實施。
Rhinogen? 重組 C 因子內(nèi)毒素檢測試劑盒
Rhinogen?重組 C 因子內(nèi)毒素檢測試劑盒是一種不依賴于動物源性成分，靈敏度高、特異性高、可穩(wěn)定且持續(xù)提供的替代鱟試劑的內(nèi)毒素測定試劑，使用此試劑進行內(nèi)毒素檢測具有相當?shù)膬?yōu)越性：
● 終點熒光測定，與其他定量 LAL 方法相當，同時提高準確性
rFC 法相比鱟試劑動態(tài)顯色法具有更高的檢測準確性
● 靈敏度范圍從 0.005 到 5EU/ml，準確性也有所提高
rFC 內(nèi)毒素檢測試劑盒的檢測靈敏度高，檢測范圍為 0.005EU/ml-5EU/ml
● 使用液體試劑，方便簡單，并且由重組表達生產(chǎn)，產(chǎn)品批間一致性良好
不同批次的 rFC 內(nèi)毒素檢測試劑盒檢測的標準曲線。表明產(chǎn)品具有良好的的批間一致性
● 內(nèi)毒素特異性檢測，無 G 因子旁路干擾 [1]
葡聚糖存在時，LAL 顯色法會受到 G因子旁路的干擾，而 rFC 法不受干擾
● 不依賴動物源性成分，符合3R的替代原則，同時提供更高的供應(yīng)安全性
Rhinogen?重組 C 因子內(nèi)毒素檢測試劑盒可替代傳統(tǒng)鱟試劑用于人用和動物用注射藥物（如化學(xué)藥品、放射性藥物、抗生素類、生物制品等）及醫(yī)療器械(如透析液、植入式器械等)的原輔材料、中間產(chǎn)品、放行產(chǎn)品的內(nèi)毒素檢測。
試劑盒采用終點熒光檢測，Molecular Devices 多款熒光/多功能酶標儀都能夠滿足檢測需要，包括：SpectraMax Gemini 系列、SpectraMax M 系列、SpectraMax i 系列、SpectraMax Paradigm。
根據(jù) Rhinogen? 重組 C 因子內(nèi)毒素檢測試劑盒的要求，我們設(shè)置了統(tǒng)一的檢測模板(如需模板請關(guān)注RhinoBio公眾號咨詢在線客服)。酶標儀溫度設(shè)置 37℃，分別在 0h 和 1h 進行相對熒光強度檢測，讀值記作 T0 和 T1。所有孔的 ΔRFU=T1-T0，標準品/樣品凈 ΔRFU= 標準品/樣品 ΔRFU- 陰性對照 ΔRFU。以內(nèi)毒素工作標準品溶液濃度為橫坐標，凈 ΔRFU 為縱坐標繪圖并進行 Log-Log 擬合，log(ΔRFU) = A*log(內(nèi)毒素濃度 EU/ml)+B。
本次推送的第二篇文章中詳細列舉了使用 4 種不同型號的 Molecular Devices 酶標儀進行重組 C 因子法內(nèi)毒素檢測的方法及結(jié)果。數(shù)據(jù)結(jié)果表明，不同型號的酶標儀均能夠進行重組 C 因子檢測，標準曲線展現(xiàn)了優(yōu)秀的線性，SpectraMax i3x R2 值達到了 1.000。多款儀器樣品 2 復(fù)孔 CV 值小于 5%，展現(xiàn)了優(yōu)異的復(fù)孔重現(xiàn)性;加標回收率在 82%~113% 之間，明顯優(yōu)于中國藥典 2020 版要求 50%~200% 的范圍。
同時，Molecular Devices 提供完整的合規(guī)解決方案，包括一整套符合 GLP/GMP 要求的儀器硬件確認和企業(yè)版軟件，能夠滿足內(nèi)毒素檢測涉及到藥物和醫(yī)療器械的原輔材料、中間產(chǎn)品、放行產(chǎn)品的檢測，數(shù)據(jù)采集和分析軟件及儀器硬件都必須符合相應(yīng)法規(guī)的要求。
企業(yè)版軟件：
SoftMax? Pro 7.1.2 GxP 是 Molecular Devices 最新、最安全的一款企業(yè)版軟件，符合全新的 FDA 21 CFR Part 11 的工作流程，以確保您獲得數(shù)據(jù)的完整性。每個步驟都經(jīng)過優(yōu)化，其目的是簡化分析流程和報告生成時間，以便于支持我們的酶標儀更快獲得完整、可靠的數(shù)據(jù)。
為了確保您的酶標儀符合要求，可通過使用完整的、系統(tǒng)的 IQOQ 服務(wù)，Molecular Devices 專業(yè)的技術(shù)團隊會通過耐心、認真的服務(wù)迅速協(xié)助您建立單機或網(wǎng)絡(luò)版的合規(guī)軟件系統(tǒng)，SoftMax Pro 7.1.2 GxP 軟件主要在數(shù)據(jù)隱私和安全性上做了重大改進，使其充分符合新版本 GDPR 規(guī)定。
[1]除了不受葡聚糖引起的 G 因子旁路干擾，重組 C 因子內(nèi)毒素檢測與經(jīng)典的鱟試劑內(nèi)毒素檢測方法一樣都會受到檢測基質(zhì)中高鹽、強酸強堿、血漿、天然熒光物質(zhì)等成分的干擾。由于檢測的干擾始終是產(chǎn)品特異性的，因此每種產(chǎn)品均應(yīng)進行正常的干擾驗證研究。