利用熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè) Avelumab的 ADCC 效應(yīng)

發(fā)布時(shí)間： 9/23/2022 2:14:21 PM

熒光素酶 (luciferase) 報(bào)告基因系統(tǒng)是一種以熒光素 (luciferin) 為底物來(lái)檢測(cè)熒光素酶活性的報(bào)告系統(tǒng)。相比于熒光蛋白，該系統(tǒng)具有靈敏度高，讀數(shù)結(jié)果穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)。近幾年，隨著生物醫(yī)藥的蓬勃發(fā)展，越來(lái)越多的藥物選擇熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)作為生物學(xué)活性檢測(cè)系統(tǒng)。Avelumab（Bavencio）是一個(gè)人IgG1抗PD-L1的人源化單克隆抗體，可解除PD-1/PD-L1介導(dǎo)的免疫抑制，促進(jìn)T細(xì)胞攻擊腫瘤細(xì)胞。Avelumab于2017年3月24日獲FDA批準(zhǔn)上市，用于成人和12歲以上兒童的轉(zhuǎn)移性默克爾細(xì)胞瘤（皮膚癌的一種）的治療。本文闡述了一種利用CD16A-NFAT-Luc報(bào)告基因系統(tǒng)評(píng)價(jià)Avelumab ADCC效應(yīng)的方法，該法相較于傳統(tǒng)PBMC/NK原代細(xì)胞的ADCC檢測(cè)方法，具有操作更簡(jiǎn)單，材料更易獲得且方法的靈敏度和精密度更高的優(yōu)勢(shì)。

關(guān)鍵詞：熒光素酶，ADCC，Avelumab。

1、靶細(xì)胞的處理

消化并離心收集PD-L1/CHO， PBS洗滌兩遍后用assay medium（RPMI1640）重懸，并將細(xì)胞密度調(diào)整為1×106 cells/mL，備用。

2、供試品處理

用assay medium將供試品稀釋至30 nM，然后再4倍梯度稀釋至第8個(gè)濃度點(diǎn)，備用。

3、效應(yīng)細(xì)胞處理

離心收集CD16A-NFAT-Luc效應(yīng)細(xì)胞，PBS洗滌兩遍后再用assay medium重懸，并將細(xì)胞密度調(diào)整為5×106cells/mL，備用。

4、孵育

在96孔白色平底板中，分別加入30 μL靶細(xì)胞，30 μL上述梯度稀釋的供試品，于37℃預(yù)孵育30分鐘。再加入30 μL效應(yīng)細(xì)胞，混合后放入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5~6 h。

5、檢測(cè)

預(yù)先取出配制好的Bio-Glory螢火蟲(chóng)熒光素酶檢測(cè)試劑使其恢復(fù)至室溫，每孔加入90 μL Bio-Glory試劑，靜置5min后，用酶標(biāo)儀收集化學(xué)發(fā)光信號(hào)。

RHINOBIO

結(jié)果與分析

酶標(biāo)儀檢測(cè)化學(xué)發(fā)光信號(hào)值（RLU），以濃度為橫坐標(biāo)，RLU值為縱坐標(biāo)，利用SoftMax軟件進(jìn)行四參數(shù)擬合，試驗(yàn)結(jié)果詳見(jiàn)圖1。結(jié)果表明Avelumab型可誘導(dǎo)明顯的ADCC效應(yīng)，且有良好的量效關(guān)系。同時(shí)表明該體系可用于抗體類(lèi)分子ADCC效應(yīng)的檢測(cè)。

1、針對(duì)不同的靶細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞，需要摸索合適的效靶比以獲得較高的信噪比。
2、效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞在做實(shí)驗(yàn)前均需要用PBS洗滌，以去除FBS對(duì)檢測(cè)的影響。
3、報(bào)告基因的表達(dá)會(huì)隨著時(shí)間呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，需要控制孵育時(shí)間，并不是時(shí)間越長(zhǎng)越好。